پاسخ های رشدی و فیزیولوژیکی گیاه ذرت (Zea mays L. ) به مس و نیکل

     مقدمه:

     محدوده وسیعی از ترکیبات آلی و غیرآلی که سبب آلودگی می شوند شامل فلزات سنگین، مواد قابل اشتعـــال و فساد پذیر، ضایعات خطرناک، تولید مواد منفجره و نفتی می باشند. جزء عمده ای از آلوده کننده های غیر آلی، فلزات سنگین هستند که مشکلات مختلفی را نسبت به آلوده کننده های آلی بوجود می آورند. میکروارگانیسم های خاک می توانند آلوده کننده های آلی را کاهش دهند در صورتی که فلزات سنگین به دلیل عدم تحرکشان نیاز به جابجایی فیزیکی دارند. گیاهان به روشهای مختلف فیزیکی و شیمیایی تحت تاثیر فلزات سنگین قرار می گیرند (4).

       عده ای از فلزات سنگین مانند روی (Zn)، کادمیوم (Cd) و مس (Cu) که در غلظت های بهینه برای رشد گیاه لازم هستند در غلظت های بالا می توانند مانع رشد و متابولیسم گردند(38). مس و نیکل عناصر ضروری برای رشد گیاهان هستند. مس به عنوان جزئی از پروتئین ها و آنزیم های دخیل در انتقال الکترون و واکنش های احیایی بوده و در بسیاری از واکنش های بیولوژیکی مهم به عنوان یک کوفاکتور آنزیمی (سیتوکروم اکسیداز و آمین اکسیداز) و همچنین بعنوان یک ناقل الکترون در فسفریلاسیون اکسیداتیو و فتوسنتز شرکت می نماید (43).

      غلظت های بالای مس در بافت های گیاهی می تواند به عنوان یک عنصر سمی در نظر گرفته شود که منجر به مهار رشد گیاهان می گردد (25). غلظت های بالای مس می تواند بسیاری از تغییرات را در یاخته القاء نماید و موجب تغییر در نفوذ پذیری غشاء، ساختار کروماتین، فعالیت های آنزیمی فرایندهای تنفس و فتوسنتز و القاء پیری گردد (38).

   مطالعات نشان داده است که کارایی فتوسنتز گیاهان مختلف با فلزات سنگین تحت تاثیر قرار می گیرد. مس مازاد مستقیماً انتقال الکترون فتوسنتزی و همچنین فعالیت های آنزیمی را در طول چرخه کالوین یا آسمیلاسیون خالص CO₂ مهار می کند. از طرف دیگر با کاهش محتوای رنگیزه های فتوسنتزی، آسیب رساندن به دستگاه فتوسنتزی و ساختار کلروپلاست، تغییر ترکیب پروتئین و لیپید غشای تیلاکوئید رشد و نمو گیاه را می تواند تحت تاثیر قرار دهد (22).

   نیکل نیز یکی از سمی ترین فلزات سنگین حاضر در فاضلاب ها به علت صنعت هایی از قبیل آب کاری فلز، رنگ سازی، مینا کاری چینی و... می باشد(34). نیکل می تواند مشکلات سلامتی جدی از قبیل حساسیت های آلرژیکی (44)، بیماریهای پوستی (6) و آسیب های سیستم عصبی و ریوی را به دنبال داشته باشد (17).

     نیکل به عنوان یک عنصر ضروری برای بسیاری از سیستم های زنده در نظر گرفته می شود و برای فعالیت های متابولیکی گیاه لازم می باشد (7) اما غلظت های بالای این عنصر برای گیاه سمی بوده و ممکن است با بسیاری از فرایند های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گیاهان مداخله نماید (7 و 35).

   مطالعات نشان داده است که نیکل مازاد می تواند جوانه زنی دانه و رشد گیاه را مهار نموده، موجب تخریب کلروفیل گردیده و با فعالیت سیستم نوری مداخله نماید (2 و 3). غلظت زیاد نیکل در سلول های آندودرم و پری سیکل، تقسیم سلولی را در پری سیکل مهار می کند و در نتیجه از ایجاد ریشه های فرعی ممانعت می نماید (35).

   در سطح سلولی نیکل و مس تولید گونه های اکسیژن دوباره فعال شده ROS)) را القاء می کند و ROSها موجب آسیب های اکسیداتیو به لیپید ها، پروتئین ها و اسید های نوکلئیک در یاخته ها می گردند (14 و 39). تیمار گیاه ذرت با نیکل 100 موجب افزایش قابل توجه غلظت H₂O₂ درونزا و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در این گیاه می گردد (11). معمول ترین علایم سمیت نیکل و مس مهار جوانه زنی، کلروزیس و نکروزیس، افزایش نشت یونی، کاهش نمو ریشه و کاهش رشد گیاه است (35).

     آلودگی فلزات سنگین یک مشکل بزرگ با خطرات محیطی جدی می باشد. با توجه به افزایش روزافزون صنعتی شدن، استفاده از کودهای شیمیایی و آفت کش ها به عنوان منابع مهم آلودگی های چند گانه فلزات سنگین، فهم چگونگی اثر یونهای مس و نیکل به عنوان یون های دو ظرفیتی، بر رشد، فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاهان ممکن است در حل مشکلات ناشی از آلودگی چند گانه فلزات سنگین بالاخص مس و نیکل موثر باشد (15) . بنابراین یکی از اهداف این تحقیق بررسی تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی، به ویژه محتوای کلروفیل در برگها، میزان مالون دی آلدهید به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، نشت یون های الکترولیت به عنوان شاخص آسیب غشاء در طی تنش، مرگ سلولی و واکنش هیل در پاسخ به تیمار توام مس و نیکل است که احتمال دارد در مسیر متابولیکی موثر باشد و هم چنین شناسایی بعضی از مکانیسم های دخیل در کاهش رشد گیـاه و تغیـــیرات توسعــه ای در برگ ها و ریشه های گیــاه ذرت (Zea mays L) به عنوان یک محصول مهم زراعی، از اهداف دیگر این کار تحقیقی بود.

مواد و روش ها

     بذرهای ذرت ((Zea mays L. بعد از تهیه از مرکز تحقیقات کشــاورزی، قبل از کشت به مدت 10 دقیقه با محلول 1/0 %  HgCl₂ضدعفونی و بعد به وسیله آب مقطر کاملاً شستشو داده شدند. ظروف پتری دیش به قطر 9 سانتی متر قبل از اقدام به کشت به مدت دو ساعت در آون در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد شدن پتری دیش ها، در هر یک از آنها دو ورق کاغذ صافی گذاشته سپس با استفاده از یک پنس استریل ده عدد بذر که 12 ساعت قبل از کشت در داخل آب مقطر قرار گرفته و دوره آماس را طی کرده بودند، در داخل آنها کشت وسپس کلیه پتری دیش ها در داخل انکوباتور در 25 درجه سانتیگراد به مدت سه روز قرار داده شدند. دانه رست ها به مدت 15 روز در اتاق کشت با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، شدت نوری µmolm^-2s^-1 150 (10000لوکس)،دمای شبانه روزی27/22 درجه سانتی گراد و رطوبت 85% در داخل گلدان های حاوی ماسه قرار گرفتند. در طی این دوره گیاهان صرفاً با محلول هوگلند بدون اعمال نیکل و مس تغذیه شدند. بعد از گذشت 15 روزگیاهان با غلظت های مختلف قلزات نیکل و مس تیمار شدند. گیاهان به هنگام اعمال تیمار بصورت یک روز در میان با آب مقطر و محلول هوگلند حاوی غلظت های مختلف نیکل(0، 100 و 200 میکرومولار )، مس (0، 50 و 100 میکرو مولار) و غلظت های مختلف  نیکل به همراه مس) 200 میکرو مولار Ni و 100 میکرو مولار Cu) و (100 میکرومولار Ni و 50 میکرومولار Cu) تغذیه شدند. برای تهیه غلظت های مختلف مس، از سولفات مسCuSO₄.5H₂O و برای تهیه غلظت های مختلف نیکل از سولفات نیکلNiSO₄ .6H₂O استفاده گردید. پس از گذشت 15 روز طول ریشه ها و ساقه ها، وزن خشک ریشه و اندام هوایی گیاهان ذرت بطور جداگانه اندازه گیری شد. برای این کار گیاهان 33 روزه ذرت جهت انجام آزمایش ها برداشت گردیدند. بعد از اندازه گیری طول ریشه و ساقه با یک خط کش تمیز، برای خشک کردن نمونه ها جهت تعیین وزن خشک و برخی آزمایشات که نیاز به وزن خشک نمونه ها داشت، ریشه ها و ساقه ها در پاکت های مجزا قرار داده شدند و در آون 80 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت قرار گرفتند. وزن خشک با ترازویی باحساسیت 001/0 گرم اندازه گرفته شد.

اندازه گیری میزان پراکسیداسیون چربی ها:

    برای اندازه گیری میزان پراکسیداسیون چربی ها از روش Heath and Packer (19) استفاده گردید. 1 گرم بافت تر توزین و توسط ml 5/2 محلول تری کلرواستیک اسید 10% خوب له گردید. بعد از 20 دقیقه سانتریفوژ با سرعتrpm 15000، حجم مساوی از عصاره رویی و تیوباربیوتیک اسید 5/0% در تری کلرو استیک اسید 20% به داخل لوله آزمایش منتقل شده و به مدت 30 دقیقه در داخل انکوباتور °C 96 قرار داده شد. در نهایت لوله ها را به مدت 5 دقیقه وارد آب یخ نموده و بعد به مدت 5 دقیقه در داخل سانتریفوژ با سرعت rpm 10000 گذاشته شد. جذب محلول حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج های nm 532 و nm 600 اندازه گیری گردید. برای محاسبه غلظت از ضریب خاموشی استفاده شد (mM^-1 cm^-1 155 = ضریب خاموشی) (18).

اندازه گیری میزان K⁺ نشت یافته به محیط کشت:

         برای انجام این آزمایش دانه رستهای 3 روزه ذرت به مدت 24 ساعت تحت تیمار ml 10 KCl mM 20، قرار گرفتند و سپس دانه رستها با آب مقطر شسته شده و با غلظت های مختلف مس تیمار شدند. پس از 48 ساعت نمونه ها برداشت شده و میران برون تراوش پتاسیم در محلول باقیمانده کلیه گیاهان توسط دستگاه فلم فتومتر (Flam photometer) اندازه گیری شد و با استفاده از منحنی استاندارد پتاسیم، میزان پتاسیم نشت یافته به محیط کشت بر حسب ppm محاسبه گردید (1).

اندازه گیری قندهای نشت یافته به محیط کشت:

     برای انجام این آزمایش دانه رستهای 3 روزه ذرت به داخل پتری دیش های محتوی غلظت های مختلف مس منتقل گردید و بعد پتری دیش ها در داخل اتکوباتور°C25 به مدت 120 ساعت قرار گرفتند سپس کاغذ صافی به همراه دانه رست ها از داخل پتریها خارج نموده و از محلول باقی مانده ml 2 به داخل لوله های آزمایش منتقل شدند بر روی هر یک از لوله ها ml 1 فنل 5% اضافه شده سپس ml 3 اسید سولفوریک 98% با فشار بر روی آنها اضافه گردید. لوله ها به مدت یک ساعت به حال خود رها شدند بعد از یک ساعت و ظهور رنگ قرمز فورفورال جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر اندازه گیری شد(1).

اندازه گیری پرولین:

     برای اندازه گیری پرولین از روش . Bates et al(5) استفاده شد. مقدار 50 میلی گرم ماده خشک گیاهی در لوله های آزمایش حاوی 10میلی لیتر اسید سولفوسالسیلیک3% قرار گرفت. بعد از 72 ساعت نمونه ها توسط کاغذ صافی صاف شدند نمونه های صاف شده برای اندازه گیری پرولین مورد استفاده قرار گرفتند. 2 میلی لیتر از هر نمونه صاف شده در هر لوله آزمایش ریخته شد و بر روی آن 2 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و 2 میلی لیتر معرف نین هیدرین(حاوی ml 20 اسید فسفریک M6، ml30 اسید استیک گلاسیال و 25/1 گرم نین هیدرین) اضافه شد. محتوای لوله های آزمایش به مدت یک ساعت در بن ماری در حال جوش حرارت داده شد سپس لوله ها در ظرف محتوی یخ سرد شدند و بعد از آن در هر لوله آزمایش 4 میلی لیتر تولوئن ریخته، بعد از هم زدن دو فاز تشکیل گردید از فاز بالایی که حاوی کمپلکس رنگی (قرمز) بود جهت اندازه گیری پرولین استفاده شد. میزان جذب در طول موج nm 520 بوسیله اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد. میزان پرولین با استفاده از منحنی استاندارد پرولین و بر حسبg/g FDµ محاسبه گردید.

اندازه گیری میزان رنگیزه ها

    برای اندازه گیری میزان رنگیزه ها از روش Dere et al. (8) استفاده شد. 1 گرم از بافت تر برگ ها توزین شده و با ml 50 استون100% له گردیده و با تنزیب صاف گردید و عصاره حاصل به مدت 10 دقیقه در داخل سانتریفوژ با دور rpm 2500 گذاشته شد و سپس برای تعیین میزان کلروفیل(Chl) a و b جذب آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm 662 و nm 645، برای تعیین کاروتنوئید کل (  C_{X+ C}) جذب آن در طول موج nm 470 اندازه گیری گردید. برای محاسبه مقادیر کلروفیل a و b و همچنین کاروتنوئید کل از فرمولLichtenaler & Wellburn  (27) استفاده گردید.

                                                                                                                                                               Chl_a = 11.75 A₆₆₂ – 2.350 A₆₄₅

  Chl_b = 18.61 A₆₄₅ – 3.960 A₆₆₂

  C_{X+ C} = 1000 A₄₇₀ – 2.270 Chl_a -81.4 Chl_b /227

اندازه گیری واکنش هیل

    برای اندازه گیری واکنش هیل از روش Patsikka et al. (35) استفاده گردید. 1 گرم از بافت تر برگ توزین گردید و باml 3 بافر فسفات که pH آن برابر 7 بود و در حد انجماد سرد گردیده بود له گردید. عصاره صاف شده را به مدت 2 دقیقه با سرعت rpm 10000 سانتریفوژ نموده و محلول رویی دور ریخته شد. روی رسوب باقیمانده ml 3 بافر فسفات سرد اضافه نموده و با قلم مو رسوب در محلول به حالت تعلیق در آمد. برای انجام واکنش هیل 5/0 میلی لیتر از محلول فوق برداشته و روی آن 2 میلی لیتر محلول بافر فسفات و 2/0 میلی لیتر محلول رنگی دی کلرو فنل ایندو فنل (DCPIP) افزده شد و بلافاصله جذب آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 550 نانو متر اندازه گرفته شد و سپس لوله را از دستگاه خارج نموده و به مدت 20 ثانیه در مقابل لامپ 150 واتی قرارداده شد و دوباره جذب اندازه گیری شد. این عمل به مدت 5 دقیقه تکرار گردید. میزان احیاء DCPIP بر حسب درصد شاهد محاسبه گردید.

مرگ سلولی:

    مرگ سلولی به عنوان معیاری برای نشان دادن آسیب واردشده به غشاء سلولی در گیاهان تیمار شده با مس، با استفاده از جذب معرف آبی اوانس (Evans blue) اندازه گیری گردید(4). بعد از تیمار با مس و نیکل، سه قطعه^ء 1 سانتی متری از نوک ریشه ها در داخل معرف آبی اوانس 025/0% در آب (w/v) به مدت 30 دقیقه قرار داده شدند و بعد به مدت 15 دقیقه با آب شستشو داده شدند و سپس در ml 1 محلول متانول 50% (v/v) و SDS 1% (w/v) له گردیدند که این عمل موجب آزاد شدن معرف به تله افتاده گردید. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در داخل بن ماری  °C50 قرار گرفته و سپس به مدت 15 دقیقه با نیروی g 14000 سانتریفوژ گردید. جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm600 اندازه گیری شد و در نهایت میزان مرگ سلولی بر حسب درصد نسبت به شاهد تعیین گردید.

آنالیز آماری

    برای آنالیز داده ها و رسم نمودارها از برنامه های رایانه ای SPSS و Excel استفاده گردید. در کلیه نموداره  بارهای عمودی نشان دهنده SE  برای سه تکرار می باشد. مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون ANOVA در سطح 5 درصد، در صورت معنی دار بودن اثر عوامل آزمایشی انجام شد.

 نتایج

    مطالعه علائم ظاهری درگیاهان ذرت شاهد و تحت تیمار غلظتهای مختلف مس ونیکل، نشان داد که افزایش غلظتهای این دو عنصردرگیاهان ذرت موجب بروز کلروز برگی شد که این کلروز به صورت رنگ سبز متمایل به زرد در برگها ظاهر گردید. باافزایش غلظت این عناصر نوک برگها وحاشیه برگها بصورت نکروزه شده درآمدند (نشان داده نشده است).

    نتایج حاصل از اثر نیکل و مس بر روی وزن خشک اندام هوایی و ریشه در نمودار شماره 1 (الف) نشان داده شده است. نتایج بیانگر وجود یک رابطه معکوس ما بین افزایش غلظت های نیکل و مس با وزن خشک ریشه ها و اندام هوایی بود. میزان کاهش وزن خشک ریشه 27 تا 52 درصد و میزان کاهش وزن خشک اندام هوایی 24 تا 62 درصد نسبت به شاهد به ترتیب در تیمارهای مس 100 میکرو مولار و 200 میکرو مولار Ni + 100 میکرو مولار Cu مشاهده گردید. کاهش وزن خشک در هر دو اندام طبق جدول شماره 1 در سطح 05/0 معنی دار بود.

    نتایج حاصل از اثر نیکل و مس برطول ریشه و اندام هوایی درگیاهان در نمودار شماره 1 (ب) آورده شده است. بررسی این نتایج در گیاهان تیمار شده نشانگر آن است که با افزایش غلظت مس و نیکل طول ریشه و اندام هوایی کاهش معنی دار یافت (جدول شماره 1) و مقایسه سمیت این دو فلز سنگین نشان داد که اثر سمیت فلز نیکل بر روی طول ریشۀ گیاه ذرت نسبت به مس بیشتر بوده و بیشترین اثر سمیت درتیمار نیکل 200 میکرو مولار مشاهده گردید. بررسی اثر توام این دو فلز بر طول ریشه و اندام هوایی نشان داد که بر همکنش این فلزات نسبت به مس اثر بیشتری بر روی طول ریشه داشته ولی نسبت به بکارگیری نیکل به تنهایی فقط در نیکل 200 میکرو مولار به همراه مس 100 میکرو مولار اثر تعدیل بر طول ریشه داشت. بررسی طول اندام هوایی نشان داد اعمال توام مس و نیکل اثر همیاری بر کاهش طول اندام هوایی داشته و بیشترین کاهش در تیمار 200 میکرو مولار Ni و 100 میکرو مولار Cu (46% نسبت به شاهد) مشاهده شد.

    نتایج حاصل از بررسی میزان کلروفیل a و b دربرگ گیاهان شاهد و تحت تیمار مس و نیکل در نمودار شماره 1 (ج) نشان داده شده است. طبق این نتایج با افزایش غلظت های مس و نیکل میزان کلروفیل a وb درکلیه گیاهان تحت تیمار کاهش نشان داد. میزان کاهش کلروفیل a 14 تا 67 درصد و میزان کاهش کلروفیل b 32 تا 79 درصد نسبت به شاهد به ترتیب در تیمار مس 50 میکرو مولار و تیمار 200 میکرو مولار Ni + 100 میکرو مولار Cu مشاهده گردید. کاهش میزان رنگیزه های کلروفیل طبق جدول شماره 1 در سطح 05/0 معنی دار بود.

      نتایج حاصل از بررسی میزان کاروتنوئید کل در برگ گیاهان شاهد و تحت تیمار مس و نیکل در نمودار شماره 1 (د) نشان داده شده است. طبق این نتایج با افزایش غلظت های مس و نیکل میزان کاروتنوئید کل در کلیه گیاهان تحت تیمار در سطح 05/0 نسبت به شاهد کاهش معنی دار یافت (جدول شماره 1). بین تیمارهای) 200میکرو مولار Ni توام با 100 میکرو مولار Cu) و(100 میکرومولار Ni توام با 50 میکرومولار Cu) تفاوت معنی داری وجود نداشت. کمترین کاهش ( 25%) در تیمار مس 50 میکرو مولار و بیشترین کاهش نسبت به شاهد (74%) در تیمار توام 200 میکرو مولار Ni + 100 میکرو مولارCu  مشاهده شد.

  نتایج حاصل از بررسی میزان K⁺ نمودار 2 ( الف)، قندهای محلول نمودار 2 (ب) نشت یافته به محیط کشت و مرگ سلولی نمودار 2 (ج) به عنوان فاکتورهای نشان دهنده صدمه فلزات سنگین مس و نیکل بر غشاء سلولی نشان داده شده است. نتایج نشان دهنده آن بود که افزایش غلظت های مس و نیکل باعث افزایش معنی دار نشت K⁺، قند های محلول و مرگ سلولی در گیاهان تحت تیمار نسبت به شاهد شد (جدول شماره 2). کمترین افزایش نسبت به شاهد در نشت یون پتاسیم (5/0 برابر) و مرگ سلولی (25/0 برابر) در تیمار نیکل 100 میکرو مولار و در نشت قندهای محلول ( 5/0 برابر) در تیمار مس 50 میکرو مولار و بیشترین افزایش نسبت به شاهد در تیمار 200 میکرو مولار + 100 میکرو مولار Cu مشاهده گردید، که در این تیمار میزان قندهای محلول نشت یافته به محیط کشت دو برابر، میزان نشت K^+، 30 برابر و میزام مرگ سلولی 5 برابر نسبت به شاهد افزایش نشان داد که نشانه همیاری Cu و Ni بر روی فاکتورهای فوق می باشد.

       میزانMDA به عنوان شاخص پراکسیداسیون چربی ها مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل از آن در نمودار شماره 2 (د) نشان داده شده است. نتایج حاصل از آزمایشات نشانگر آن است که میزان MDA با افزایش میزان غلظت مس و نیکل در گیاهان تحت تیمار هم در اندام هوایی و هم در ریشه افزایش معنی داری نسبت به گیاهان شاهد یافت (جدول شماره 2). طبق نتایج حاصله کمترین افزایش نسبت به شاهد در میزان MDA  اندام هوایی در تیمار مس 50 میکرو مولار ( 54%) و در ریشه ها در تیمارمس 100 میکرو مولار (48%) و بیشترین اثر سمیت در هر دو اندام در تیمــار 200 میکرو مولار Ni توام با 100 میکرو مولار Cu مشاهده گردید، در این تیمار میزان افزایش MDA نسبت به شاهد در اندام هوایی 190% و در ریشه ها 152% بود.

       نتایج حاصل از بررسی واکنش هیل در نمودار شماره 3 (الف) آورده شده است. طبق این نتایج واکنش هیل با افزایش غلظت مس و نیکل در گیاه ذرت کاهش می یابد که میزان کاهش در گیاهان تحت تیمار نسبت به شاهد طبق جدول شماره 2 معنی دار بود. بین تیمارهای نیکل 100 میکرومولار و مس 50 میکرومولار و همچنین بین تیمارهای (نیکل 200 میکرو مولار توام با مس 100 میکرو مولار) و ( نیکل 100 میکرو مولار توام با مس 50 میکرومولار) تفاوت معنی داری مشاهده نگردید. حداکثر میزان کاهش نسبت به شاهد در واکنش هیل در تیمارهای فوق 67% و حداقل (48%) در تیمار نیکل 100 میکرو مولار بود.

    نتایج حاصل از بررسی محتوای پرولین در گیاهان تحت تیمار با مس و نیکل در نمودار 3 (ب) آورده شده است. نتایج نشانگر آن است که با تیمار مس و نیکل محتوای پرولین در اندام هوایی ذرت به غیر از تیمار 50 میکرو مولار مس و ریشه افزایش معنی دار یافت. در اندام هوایی بیشترین افزایش نسبت به شاهد در تیمار نیکل 200 میکرومولار (107%) مشاهده گردید. بیشترین محتوای پرولین در ریشه ها در تیمار نیکل 200 میکرو مولار توام با مس 100 میکرو مولار مشاهده شد که در این تیمار میزان پرولین نسبت به شاهد 29% افزایش یافت. محتوای پرولین در اندام هوایی نسبت به ریشه ها بیشتر افزایش نشان داد. افزایش میزان پرولین در هر دو اندام در گیاهان تحت تیمار نسبت به شاهد طبق جدول شماره 2 معنی دار بود.

بحث

    مطالعه علائم ظاهری در گیاه ذرت تحت تیمار غلظت های مختلف مس و نیکل نشان داد که غلظت های افزایش یافته این عناصر رشد گیاه را کاهش می دهند. با افزایش غلظت مس در گیاهان برگ ها علایم سمیت را بصورت زردی (کلروز) برگی و نکروزه شدن حاشیه برگی نشان دادند که با افزایش غلظت های مس بر شدت نکروزیس حاشیه برگ ها افزوده گردید. این نتایج با نتایج حاصل از کار Zhu & Alva (47) هم خوانی نشان می دهد. احتمال داده می شود که ظهور کلروز برگی در اثر سمیت مس به دلیل اثر مس اضافی بر کاهش جذب آهن باشد (26). نیکل یکی از فلزات سنگینی است که در صنعت های مدرن به عنوان فلز سمی وسرطان زا گروه بندی می شود. در این مطالعه غلظت های آزمایش شده نیکل باعث کاهش در وزن خشک، کاهش رشد اندام هوایی و کاهش رشد ریشه گردید. در تحقیقات بر روی گیاهان مختلف، علایم سمیت این عنصر که شامل کاهش جوانه زنی دانه، کاهش رشد ریشه، القاء کلروزیس برگی و کاهش بیومس می باشد، نیز مشاهده گردیده است (7). همچنین کاهش مشابه در بیومس گندم وکلم نیز گزارش شده است (46). احتمال داده می شود که کاهش در بیومس ناشی از تغییرات فرایندهای متابولیکی القاء شده توسط فلز نیکل (40) و کاهش محتوای آب گیاه باشد (41).

   وزن خشک دانه رست های ذرت تحت تیمار با مس شدیداً کاهش یافت. در غلظت های بالای مس کاهش رشد ریشه نسبت به کاهش رشد ساقه بیشتر بود که نشان دهنده آن است که رشد ریشه به استرس مس حساس تر از رشد اندام هوایی می باشد. کاهش معنی دار در وزن خشک ریشه ناشی از اثر سمیت در این اندام است . بدلیل اینکه ریشه اولین اندامی است که در معرض سمیت قرار دارد و بیش از سایر اندام ها در معرض آسیب عوامل بیرونی قرار می گیرد در واقع می توان بیان نمود که ریشه به طور مستقیم در معرض سمیت مس قرار دارد، اما سمیت مس در سایر قسمت های گیاه به طور غیر مستقیم می باشد. اثر کاهش بیوماس ریشه و رشد آن در اثر مسمومیت مس در گیاهان، در تحقیقات مشابه توسطXu et al.  (45) گزارش شده است. تاثیر نسبی مقادیر زیاد نیکل در گندم منجر به کاهش رشد اندام هوایی می گردد این احتمال داده می شود که فلزات سنگین رشد ریشه و ساقه را مستقیما بوسیله مهار تقسیم سلولی یا تطویل سلولی یا بوسیله ترکیبی از هر دو مهار می نمایند (42).

 Ghasemi et al.   (15)، در مطالعات خود بر روی گیاه Alyssum inflatum  نشان داده اند که تیمار این گیاه با غلظت های مختلف مس در حضور و غیاب Ni موجب تجمع مس بیشتر در ریشه ها و اندام هوایی در حضور نیکل نسبت به عدم حضور آن در محیط کشت می گردد. این پیشنهاد می کند که نیکل جذب مس را در این گیاه تحریک نموده است. در این تحقیق اعمال توام مس و نیکل بر روی گیاهان ذرت، موجب تشدید کاهش رشد در ذرت گردید که این نتایج با نتایج بدست آمده توسط Ghasemi et al. (15)، بر روی گیاه  Alyssum inflatum و Monni et al. (30)، بر روی Empetrumnigrum هم خوانی نشان می دهد. با توجه به اینکه هر دوی این عناصر اثرات منفی بر روی تقسیم و تطویل سلولی دارند بنابراین تاثیرات توام این دو عنصر باعث تشدید کاهش رشد شد.

    در این تحقیق محتوای کلروفیل a، کلروفیل  bو کاروتنوئید ها تحت تاثیر غلظت های سمی مس و نیکل کاهش نشان داد. مکانیسم تاثیر فلزات سنگین بر روی پیگمان های فتوسنتزی ممکن است به سه دلیل باشد:

      1- با ورود فلزات سنگین به داخل کلروپلاست ها و تجمع بالای آنها در این اندامک ممکن است تنش های اکسیداتیورخ دهد که موجب آسیب هایی از قبیل پراکسیداسیون کلروپلاست ها می شوند (34). همچنین آنها می توانند بطور مستقیم ساختار وعملکرد کلروپلاست ها را با اتصال به گروههای سولفهیدریل آنزیم ها از هم گسیخته و روی هم رفته بیوسنتزکلروفیل را تحت تاثیر قرار دهند (37).

     2- فلزات سنگین جذب و انتقال سایر عناصر ضروری از قبیل Fe²⁺، Mn²⁺وZn²⁺ را بوسیله تاثیرات ضدیت مهار می نمایند و بنابراین از این طریق ظرفیت سنتز پیگمان ها در برگها تحت تاثیر قرار می گیرد (14).

    3- مشخص شده است که فلزات سنگین در یکی از مراحل آنزیمی تاثیرات مهار کنندگی مستقیم دارند (36). بعلاوه مس مازاد کلروزیس برگی را القاء می نماید که بعلت شکسته شدن پراکسیداتیو رنگیزه ها و لیپید های غشاء و کاهش در محتوای رنگیزه ها می باشد (28).

    کاهش محتوای کلروفیل a و کلروفیل b میتواند در نتیجه کمبود  Mgو Fe در گیاهان در زیادی نیکل (33)، افزایش تولیدات ROS ایجاد شده توسط نیکل و یا تحریک فعالیت کلروفیلاز بوسیله این فلز باشد (18). همچنین کاهش محتوای کلروفیل ممکن است ناشی از تخریب کلروفیل و مهار سنتز کلروفیل بعلت مهار القاء کنندگی مس بر روی ALA دهیدراتاز (Aminolaevulinic acid dehydratase) باشد (13).

    در بررسی اثرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مس و نیکل بر دانه رست های ذرت اثرات این دو عنصر بر پایداری غشای سلول های ریشه با اندازه گیری میزان MDA و برون تراوشK⁺ بررسی گردید. پتاسیم یک کاتیون تک ظرفیتی بوده و یک عنصر پر مصرف ضروری و مهم است که در داخل سیتوپلاسم و واکوئل تجمع می یابد (16). در این مطالعه غلظت های بالای نیکل منجر به افزایش پراکسیداسیون لیپیدی در دانه رست های ذرت گردید. MDA یکی از محصولات پراکسیداسیون لیپیدی است که به عنوان شاخص آسیب های اکسیداتیو در نظر گرفته می شود (29). پراکسیداسیون لیپیدها تاثیرات مخرب بر روی غشاء یاخته و فراساختار غشاء دارد (43). گونه های اکسیژن فعال می توانند با اسید های چرب غیر اشباع واکنش دهند که باعث پراکسیداسیون لیپیدهای ضروری در غشاء یاخته و اندامک ها می گردند. پراکسیداسیون لیپیدی با استرس های اکسیداتیو مرتبط بوده و شامل شکسته شدن تمامیت غشاهای بیولوژیکی، عملکردی و ساختاری می باشد که باعث افزایش در نفوذپذیری غشای پلاسمایی می شود که  نشت یونK⁺ و سایر محلول ها مثل قندهای محلول را در پی داشته و نهایتاً منجر به مرگ سلولی می گردد. در مطالعه حاضر محتوای مالون دی آلدهید در دانه رست های ذرت بطور قابل توجهی در تیمار با مس و نیکل افزایش نشان داد. نتایج مشابهی توسط  Eriyamremu et al.(12) در گیاه ذرت در تیمار با نیکل گزارش شده است. افزایش در محتوای MDA نشانگر آن است که این فلزات موجب تنش های اکسیداتیو شدید با تحریک تولید ROS می شوند (9). از آنجاییکه مس و نیکل هر دو باعث افزایش نشت K⁺ و کاهش محتوای آن در داخل سلول می شوند و از طرف دیگر، نیکل فعالیت شلات ردوکتاز II Cu سطح ریشه را نیز تحریک کرده و باعث افزایش جذب مس می شود بنابراین این عمل منجر به افزایش مس داخل سلولی و افزایش اثرات سمیت این دو عنصر بر روی میزان نشت K⁺ و محتوای MDA در این مطالعه گردیده است.

     محتوای پرولین در اندام هوایی و ریشه گیاهان ذرت با افزایش غلظت های مس و نیکل افزایش می یابد این نتایج با نتایج سایر پژوهشگران بر روی گیاهان دیگر هم سویی نشان می دهد (24). پرولین در تیمار فلزات سنگین در گیاه تجمع می یابد و در تحمل به تنش ها نقش دارد. پرولین تحمل استرسی گیاهان را از طریق عملکردهایی از قبیل تنظیم اسمزی، محافظت آنزیمی در مقابل دناتوره شدن و پایداری سنتز پروتئین افزایش می دهد. بعلاوه پرولین می تواند در شلات کردن فلزات در سیتوپلاسم نقش ایفا نماید (25). پرولین آزاد اغلب بعنوان عامل تنظیم کننده ی اسمزی در نظر گرفته می شود و یک آمینو اسید با بیشترین قابلیت حل شدن در آب می باشد که ممکن است آبگیری سلول های گیاهی و بافت ها را بهبود بخشد و مانع از دست دادن آب برگ ها تحت شرایط تنش فلزات سنگین شود (23).

  واکنش هیل دربرگهای ذرت تحت تیمار مس و نیکل دراین مطالعه کاهش نشان داد. بارزترین اثر سمیت مس در فتوسیستم  II جلوگیری از آزاد سازی اکسیژن است که با خاموش سازی فلوئورسانس متغییر همراه می باشد (20). مشخص گردیده است که PSII نسبت به PSI نسبت به سمیت مس جایگاه حساستری می باشد. توانایی دهنده الکترون اگزوژن درنگهداری فعالیتPSII درحضور مس نشان دهنده آن است که آسیب ازجایگاه دهنده  PSIIآغاز می گردد (32). درغیاب اهدای الکترون ازکمپلکس آزاد سازی اکسیژن،P680⁺ به مدت طولانی تری به حالت اکسید باقی می ماند. به علاوه Jegerschod et al. (21) پیشنهاد نموده اند که ماده باند شونده بهCu²⁺ نزدیک  Y_Zبا سرعت بسیار پایینی دهنده الکترون اولیه اکسیدشده P680⁺را احیا می کند.

       سیستم شکافنده آب هدف اصلی سمیت نیکل است و مرکز واکنشهای  PSIIتوسط نیکل مورد حمله قرار می گیرند و هدف های بعدی نیکل محل دهنده و گیرنده PSII و آنتن ها می باشد (10). در دانه رست های ذرت تیمار شده با نیکل µmol200 بمدت 13 روز فتوسنتز بطور قابل توجهی پایین تر از کنترل است و این با کاهش قابل توجه در فعالیت انتقال الکترون در مسیر  DCPIP(دی کلر فنل ایندوفنل) همراه است. این تغییرات تاثیرات مخرب نیکل را بر روی مرکز واکنشی PSII منعکس می نمایند و می تواند ناشی از تنش های اکسیداتیو القاء شده توسط نیکل باشد که منجر به تغییر یا قطعه قطعه شدن پروتئین D1 در مرکز واکنشی PSII می گردد (18).

نتیجه گیری

   در کل می توان بیان نمود که مس و نیکل تاثیرات منفی بر رشد گیاه ذرت داشته و محتوای رنگیزه ها و واکنش هیل در حضور مقادیر سمی این فلزات کاهش چشمگیری نشان می دهد که با کاهش رنگیزه ها و واکنش هیل که هر دو در امر فتوسنتز دارای نقش عمده ای می باشند میزان فتوسنتز کاهش یافته پس در نتیجه اعمال هر یک از فلزات ذکر شده و همچنین اعمال توام آن دو موجب کاهش رشد گیاه ذرت می شود. تشدید کاهش رشد در تیمار توام این دو فلز سنگین خود دلالت بر وجود اثر همیاری این دو عنصر در این گیاه می باشد. همچنین افزایش میزان MDA، نشت الکترولیت ها، افزایش مرگ سلولی و محتوای پرولین نیز در این گیاه در حضور سمیت توام این دو عنصر نسبت به حضور تک تک آنها نشان دهنده وجود تنش اکسیداتیو با اعمال فلزات سنگین مس و نیکل و اثر همیاری این دو فلز سنگین در گیاه ذرت می باشد.