1دانشیار مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند- سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
2دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد ورامین- پیشوا.
3استادیار مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران.
4استادیار گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران
چکیده
بیماری پوسیدگی ریزوکتونیایی ریشه و طوقه مهمترین بیماری قارچی در مزارع چغندرقند کشور بوده و موثرترین روش مدیریت این بیماری، اصلاح رقمهای مقاوم به آن می باشد. برای غربال ژنوتیپی لاینهای اصلاحی چغندرقند نیاز به نشانگرهای مولکولی پیوسته به ژن های مقاومت به عامل بیمارگر ریزوکتونیا است. در این تحقیق توالیهای مجاور یک نشانگر مولکولی SNP شناسایی شده در دانشگاه پادوای ایتالیا دریافت و در مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند، جفت آغازگرهای اختصاصی طراحی و به یک نشانگر ناجفت STS موسوم به SR2-r با قابلیت PCR استاندارد تبدیل شد. این نشانگر ناجفت قادر به شناسایی ژنوتیپهای مقاوم خالص در جایگاه ژنی مرتبط با نشانگر میباشد. برای بررسی تکرارپذیری و تأیید نشانگر ناجفت SR2-r، ابتدا تودهها و لاینهای اصلاحی متعددی از ژرمپلاسم موجود مؤسسه در کرتهای آزمایشی میکروپلات یا در گلخانه در زمانهای مختلف کشت شدند. سپس ریشه-های توسعه یافته با دانههای ذرت آغشته شده به بیمارگر ریزوکتونیا تلقیح شدند. نمونههای برگی از بوتههای تلقیح شده تهیه و تا زمان استفاده در فریزر c◦70- نگهداری شدند. پس از گذشت چند هفته از زمان تلقیح، تک ریشهها از میکروپلات یا گلدانها برداشت و نمره آلودگی به بیماری ریزوکتونیا در هر یک از ریشهها یادداشتبرداری و شاخص آلودگی هر ژنوتیپ برآورد و سپس ژنوتیپها گروهبندی شدند. در مرحله بعد، بوتههای حساس و مقاوم انتخاب و از برگ های فریز شده آنها استخراج DNA انجام گرفت. آزمون مولکولی PCR با آغازگرهای مربوط به نشانگر ناجفت در DNA بوتههای حساس و مقاوم انجام گرفت و حضور و عدم حضور نشانگر در تک بوتهها مشخص شد. در مرحله بعد، ارتباط بین نتایج نشانگر مولکولی ناجفت با نمره آلودگی به بیماری به صورت مقایسه جفتی در تمام بوتههای آزمون شده بررسی شد. نتایج حاکی از توافق 87 درصدی بین نشانگر مولکولی با مقاومت فنوتیپی در شرایط گلخانه یا میکروپلات بود. این نشانگر ناجفت قادر به شناسایی 48 درصد از بوتههای مقاوم به ریزوکتونیا بود، اما با توجه به حضور غیرقابل انتظار باندهای بسیار ضعیف در برخی ژنوتیپ های هموزیگوت مقاوم، پیشنهاد می گردد در صورت امکان از Real-time PCR استفاده شود.
1Associate Professor of Sugar Beet Seed Institute (SBSI) - Agricultural Research Education and Extension, Karaj,Iran
2Ph.D. student of plant pathology, Varamin – Pishva Branch, Islamic Azad University.
3Assistant Professor of Sugar Beet Seed Institute (SBSI), Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
4Department of Plant Protection, College of Agriculture, Varamin-Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin, Iran
چکیده [English]
Rhizoctonia root and crown rot is the most important fungal disease in sugar beet fields in the Iran and the most effective way to manage this disease is to develop resistant varieties. For genotypic screening of improved sugar beet lines, molecular markers linked to resistance genes to rhizoctonia pathogen are needed. In this research, the flanking sequences of a SNP molecular marker identified at the university of Padua, Italy were obtained and at the Sugar Beet Seed Institute, a pair of specific primers were designed and converted into a repulsion STS marker called SR2-r with normal PCR capability. This repulsion marker is able to identify homozygous resistant genotypes in the gene locus related to the marker. To check the reproducibility and confirm the repulsion marker SR2-r, first, several populations and breeding lines of the available germplasm of the Sugar Beet Seed Institute (SBSI) were cultivated in microplots or in the greenhouse at different times. Then, the developed roots were inoculated with corn seeds infested to rhizoctonia pathogen. Leaf samples were prepared from the inoculated plants and kept at -70°C until use. After a few weeks of inoculation, single roots were taken from microplots or pots, and the rhizoctonia disease score in each root was recorded and disease index of each genotype calculated and the genotyps classified. In next step, susceptible and resistant plants were selected and DNA was extracted from their frozen leaves. PCR molecular analysis was performed with primers related to the repulsion marker in the DNA of susceptible and resistant plants and the presence and absence of the marker in single plants was determined. In the next step, the relationship between the repulsion molecular marker results and the rhizoctonia disease score was studied in the form of a pairwise comparison in all the tested plants. The results showed 87% agreement between molecular markers and phenotypic resistance in greenhouse or microplot conditions. This repulsion marker was able to identify 48% of rhizoctonia resistant plants. However, due to the unexpected presence of very weak bands in some resistant homozygous genotypes, it is suggested to carry out real-time PCR if possible.